INTRODUCCIÓN

El maíz suave (Zea mays L. var. amylacea) es uno de los cultivos más importantes en la sierra ecuatoriana debido a la gran cantidad de terreno destinado a su producción y al papel que cumple como componente básico de la dieta de la población rural [1]. Para el 2015 la superficie cosechada de maíz suave (solo y asociado) en choclo fue de 42448 ha y de maíz suave seco fue de 45874 ha [2].

El incremento en el rendimiento de esta especie está estrechamente relacionado con la fertilización. Después del nitrógeno, el fósforo constituye uno de los elementos más importantes en las primeras etapas del desarrollo normal de las plantas, una deficiencia de estos elementos en el cultivo puede provocar un crecimiento lento, poco desarrollo del sistema radicular y por ende una disminución el rendimiento de la cosecha [3].

En el Ecuador, el uso de fertilizantes en la agricultura constituye un grave problema de contaminación ambiental y perjuicio a la salud de la población expuesta a este tipo de componentes químicos [4]. Con la meta de mejorar la producción y el rendimiento agronómico de los cultivos se emplean fertilizantes químicos, los cuales al ser deficientemente asimilados por los cultivos terminan contaminando los suelos y la biodiversidad microbiana deteriorando así la calidad del suelo [5].

En los últimos años se han desarrollado alternativas para disminuir el uso de los fertilizantes sintéticos a través del uso de microorganismos benéficos que han demostrado cumplir funciones que mantienen el equilibrio del suelo y apoyan el crecimiento vegetal mediante diversos mecanismos, entre ellos está la solubilización de fosfatos y fijación de nitrógeno [6]. Actualmente, es de vital importancia investigar la microbiota del suelo con la finalidad de obtener estrategias que mejoren la productividad agrícola y disminuyan el uso de agroquímicos. Una de estas estrategias, es la aplicación de biofertilizantes provenientes de microorganismos benéficos los cuales asociados a las plantas pueden mejorar su crecimiento, desarrollo y rendimiento. Entre los géneros de rizobacterias más utilizados en la producción de biofertilizantes para gramíneas se encuentran; Azospirillum, Pseudomonas y Azotobacter [7].

El género Azospirillum y Pseudomonas, pertenecen a la subclase alfa de las proteobacterias, gram negativas. [8-9]. Estos microorganismos del suelo producen importantes efectos en la planta como, una implantación más rápida, mayor crecimiento de raíces, mayor tolerancia a patógenos, fijación biológica no simbiótica de nitrógeno y solubilización de nutrientes como el fósforo [10]. Una de las bondades agronómicas más considerables que se atribuyen a Azospirillum es su capacidad de promover el crecimiento vegetal y fijación de nitrógeno en los primeros estadios del ciclo del cultivo, especialmente bajo estrés moderado [11]. En tanto que los efectos atribuidos a Pseudomonas pueden resumirse en una acción de biocontrol, secreción de sustancias inductoras y solubilización de nutrientes como el fósforo [12].

Los biofertilizantes son productos a base de microorganismos que viven normalmente en el suelo, en poblaciones bajas, y que al incrementar sus poblaciones por medio de la inoculación artificial, son capaces de poner a disposición de las plantas una parte importante de los nutrientes que necesitan para su desarrollo, así como de suministrar sustancias hormonales o promotoras del crecimiento tales como auxinas, giberelinas, citocininas, etileno y ácido abscísico [13]. El uso de biofertilizantes elaborados a base de microorganismos benéficos Rhizobium, Azotobacter, micorrizas, Azospirillum, Pseudomonas, que viven asociados o en simbiosis con las raíces de las plantas, contribuyen eficientemente al proceso de nutrición de los cultivos y el mejoramiento de la fertilidad natural de los suelo proporcionando un efecto agrobiológico positivo en los cultivos agrícolas [14].

En relación a los biofertilizantes se ha generado un movimiento comercial, cuya producción y comercialización está encaminada al fortalecimiento de un sistema de producción sostenible y equilibrio ecológico del suelo al disminuir total o parcialmente el uso de fertilizantes sintéticos [15]. En este sentido, podría decirse que la microflora rizosférica es un potencial aliado de la agricultura para el uso de los recursos de manera sostenible [16]. El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la aplicación de un biofertilizante a base de una cepa de (Azospirillum sp.) fijadora de nitrógeno y una cepa solubilizadora de fósforo (Pseudomonas fluorescens) en el cultivo de maíz de altura.

MATERIALES Y MÉTODOS

La presente investigación se desarrolló en dos etapas en el período comprendido entre agosto del 2016 y marzo 2017 en la Estación Experimental Santa Catalina del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), localizada enla provincia de Pichincha, Cantón Mejía, Parroquia Cutuglagua. La primera etapa se llevó a cabo en condiciones de laboratorio con el objetivo de reactivar y purificar las cepas nativas liofilizadas de Azospirillum sp (C2) y Pseudomona fluorescens (nI5). Varios aislados de ambos géneros bacterianos se obtuvieron años atrás a partir de aislamientos colectados en la rizósfera del cultivo de maíz en su fenología V7 en las principales provincias maiceras de la sierra del Ecuador: Imbabura, Pichincha, Bolívar y Chimborazo. Con la ayuda de un barreno se tomó aproximadamente 3 kg de suelo a una profundidad de 15 cm. Las muestras de suelo fueron ingresadas al laboratorio del Programa de Maíz perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), en donde se realizaron los trabajos de aislamiento, purificación, identificación, liofilización y trabajos de inoculación en condiciones controladas de invernadero y campo donde se seleccionaron los aislados C2 (A. sp) y nI5 (P. fluorescens). El lugar de procedencia de estos aislados se encuentran descritos en la Tabla 1.

Para la reactivación de las cepas liofilizadas se colocó 1000 ^L de peptona al 1%, en los tubos Eppendorf, mediante agitación hasta homogenizar la mezcla con la ayuda del vortex. Seguidamente, se tomaron 50 ^L del inóculo y se colocaron en placas Petri con el medio de cultivo sólido ácido málico- Agar-Rojo Congo para el caso de Azospirillum sp y King B para Pseudomonas fluorescens y con la ayuda de un triángulo de vidrio estéril se dispersó bien hasta la sequedad. Posteriormente se lo colocó en la incubadora a una temperatura de 30 °C por 7 días, pasado este tiempo se tomaron secciones puras de la bacteria con la ayuda de un haza de platino y se colocaron en placas Petri con los medios de cultivos específicos para estos géneros. La preparación del biofertilizante se realizó sobre un soporte líquido a base de melaza al 2% a una concentración bacteriana de 1x10⁹ UFC.g^-1.

La segunda fase de la investigación se realizó en condiciones de campo en un suelo Andisol, sin registros de cultivos previos. El experimento fue desarrollado en campo de agricultores de la lotización la UNIÓN, ubicada en Ecuador, Cantón; Quito, Provincia de Pichincha, Parroquia; Amaguaña, con una superficie neta de 900 metros cuadrados. Se ubica a -0.386075° (S) y -78.500944° (W), con una altitud de 2675 msnm Fig 1.

La preparación del suelo se realizó a mediados del mes de septiembre del 2017 y la siembra se realizó el 23 de noviembre, utilizándose la variedad de maíz suave INIAP-101, cuyas principales características son la precocidad, de color de grano blanco y textura harinosa. Su progenitor es la variedad “Cacahuazintle” introducida por el INIAP desde México. Los biofertilizantes a base de las cepas de Azospirillum sp. y Pseudomonas fluorescens, indicados anteriormente, fueron aplicados directamente a la semilla de maíz sin desinfectar.

Implantación de las parcelas dentro del lote fue de 5 m x 3.20 m, con cuatro surcos, que incluyeron 80 plantas por parcela, equivalente a una densidad de 50000 plantas. ha^-1. La siembra se realizó a una distancia entre surcos de 0.80 m y entre planta de 0.25 m. Los tratamientos fueron cinco de acuerdo al manejo: T1 (Azospirillum sp.), T2 (Pseudomonas fluorescens), T3 (A. sp. + P. fluorescens), T4 (fertilización química con N y P) y T5 (control absoluto sin inoculación ni fertilización química), con seis réplicas, los cuales se ubicaron con un diseño experimental de bloques completamente al azar.

Las labores culturales de deshierba y aporque se realizaron de forma manual para mantener el ensayo libre de malezas. Se realizó una sola aplicación de insecticida a los cinco meses para el control del gusano del choclo (Heleiothis zea). La cosecha se realizó a los siete meses en maíz tierno, en estado de choclo.

Adicionalmente al peso de materia seca de raíces (MSR) y de parte aérea de la planta (MSPA), se evaluaron los siguientes parámetros:

Índice de efectividad de la inoculación de la materia seca (%)

En el momento de la cosecha en estado tierno (choclo), se procedió a la evaluación de la masa seca de la parte aérea en kg por planta y se calculó el índice de efectividad de la inoculación (IEI) expresado en porcentaje utilizando la siguiente formula:

Análisis químico de nitrógeno y fósforo presentes en el suelo

A la cosecha del maíz en estado tierno (choclo), por cada parcela neta se realizó un análisis químico de nitrógeno y fósforo presentes en el suelo. Estas muestras fueron ingresadas al laboratorio de Suelos del INIAP, en donde fueron analizadas mediante los métodos semimicro Kjendah para nitrógeno total y mediante Olsen para fósforo [17].

Análisis químico de nitrógeno y fósforo presentes en el tejido foliar

Se tomaron cinco plantas por tratamiento en estado lechoso (R3) para realizar el análisis de nitrógeno y fósforo presentes en la planta. Las muestras fueron secadas e ingresadas al laboratorio del Departamento Nacional de Suelos y Aguas del INIAP, donde fueron analizadas mediante los métodos (semimicro Kjendah) para nitrógeno total y mediante el reactivo de Bartons (metavanadato y molibdato) para la determinación del fósforo [17].

RESULTADOS

Existieron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos para la variable de materia seca de la raíz (MSR). El mejor tratamiento fue con la combinación de Azospirillum y Pseudomonas (T3) que obtuvo el mayor peso con un valor de 0.14 kg.planta^-1, diferenciándose estadísticamente del control absoluto sin inoculación Tabla 2. Se debe destacar que los tratamientos con la inoculación individual de biofertilizantes y el control de químico (con fertilización N y P) no mostraron diferencias significativas entre sí. Un comportamiento muy similar se observó en la producción de materia seca de la parte aérea (MSPA) existiendo diferencias significativas entre ambos controles.

En la Fig. 2 se observa que el nitrógeno (N) disminuyó en todos los tratamientos en comparación al análisis de suelo inicial que fue de (57.00 ppm). En cuanto al fósforo (P) presente en el suelo se observó un aumento de 0.68 ppm para el tratamiento T3 y 1.13 ppm para el tratamiento T4; no así en los tratamientos T1, T2 y T5 en donde los niveles de fósforo disminuyeron en relación al análisis de suelo inicial, el cual fue de 11.00 ppm. Por otro lado el testigo con fertilización química tuvo el mayor contenido de fósforo en la solución del suelo.

En la Tabla 3 se muestran los porcentajes de (N, P, K, Ca, Mg) presentes en el tejido foliar del cultivo de maíz en su estadio fenológico (R3). El tratamiento T3 (Azospirillum sp. + Pseudomonas fluorescens) presentó un mayor porcentaje de acumulación de (N, P, K) en el tejido foliar, en comparación con los tratamientos T4 (control químico) y T5 (control absoluto).

Como se observa en la Fig. 3, los mayores contenidos de nitrógeno foliar absorbido por la planta en el momento de la cosecha en estado choclo correspondieron a los tratamientos con la inoculación individual y combinada de A. sp. y P. fluorescens (tratamientos T1, T2 y T3), los cuales no difieren significativamente entre sí (p>0.05), pero con diferencias significativas con respecto a los tratamientos controles con fertilización química (con N y P) y control absoluto.

En cuanto al contenido de P, no se observaron diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos T1, T2, T3 y T4. Se observaron diferencias significativas entre el tratamiento T1 (Azospirillum sp.) y control absoluto T5 Fig. 4.

DISCUSIÓN

La materia seca de la parte aérea (MSPA) y la raíz (MSR) e índice de efectividad de la inoculación (IEI) de maíz muestran que los biofertilizantes inoculados afectaron positivamente la producción de materia seca de la parte aérea y la raíz, obteniéndose valores de índice de eficiencia a la inoculación (IEI) superiores a ambos controles.

Las hormonas de crecimiento contenidas en los biofertilizantes, a base de Pseudomonas fluorescens, incrementaron la longitud radicular (resultados no mostrados), mientras que la aplicación de hormonas de crecimiento contenidos en biofertilizantes a base de Azospirillum sp., incrementaron la biomasa vegetal al alcanzar los mayores valores en la fijación de nitrógeno, con un efecto positivo en el desarrollo vegetativo del maíz, incrementando la masa seca de la parte aérea y raíces de las plantas. El incremento de la biomasa vegetal estaría relacionado con el efecto de las fitohormonas tales como: auxinas, giberelinas, citocininas, etileno y ácido abscísico, liberados en los exudados metabólicos por parte de las bacterias promotoras del crecimiento [18-19].

La absorción de fósforo en las primeras etapas del desarrollo de la planta de maíz influye en el contenido de biomasa y en el área foliar, ya que este nutriente juega un papel importante en la morfogénesis y expansión foliar, lo cual permite una mejor captación de energía radiante [20]. En estudios similares realizados sobre la caracterización y evaluación de bacterias Pseudomonas fluoresces presentes en la rizósfera del maíz, se mostró que las plantas de maíz inoculadas con cepas de P. fluorescens, al absorber fósforo eficientemente, obtuvieron altos porcentajes de materia seca y área foliar con respecto al testigo absoluto [21].

Otros estudios realizados en el cultivo del arroz (Oriza sativa L), con el uso de cepas nativas de Azospirillum sp., reportaron un incremento significativo en la masa seca de la parte aérea, respecto al control absoluto, con índices de efectividad de 102,06 % (GM- 57); 88,24% (GM-86); 58,53% (GM-84) y 52,65% (GM-47) [22].

Sobre el análisis químico de N y P presentes en el suelo antes de la siembra y a la cosecha, los resultados podrían estar relacionados con el hecho de que el cultivo del maíz requiere para su desarrollo y producción cantidades importantes de nitrógeno (N), fósforo (P), potasio (K), calcio (Ca), magnesio (Mg), azufre (S) y en menor cantidad micronutrientes, los cuales son extraídos en su totalidad del suelo. Razón por la cual el (N) acumulado en el suelo disminuyó en un 69% al finalizar el experimento, ya que el (N) es absorbido y acumulado por la planta en pre y post floración [23].

Los resultados del análisis del contenido de fósforo en el suelo una vez finalizado el experimento muestran que los tratamientos (Azospirillum + Pseudomonasfluorescens) y el control químico (con N y P) aumentaron el contenido de fósforo, estos resultados podrían estar dados a la capacidad que tienen estos microorganismos solubilizadores de fosfato para reducir el pH mediante la secreción de diferentes tipos de ácidos, lo cual permite bajar el pH de la rizósfera y consecuentemente, disociar las formas de enlaces de fosfato que vuelven este elemento no asimilable, permitiendo que el fósforo disponible en el suelo aumente en los tratamientos inoculados a base de cepas P. fluorescens y A. sp [24]. Resultados similares fueron obtenidos en estudios realizados sobre la evaluación de bacterias Pseudomonas, solubilizadoras de fosfato, presentes en la rizósfera del maíz (Zea mays L.), encontrando un aumento de fósforo en un promedio de 18 ppm, para la mayoría de tratamientos. [21].

En el presente estudio, el suelo marcó un pH inicial de 6.5 y un pH final a la cosecha de 5.8. Estos resultados nos muestran que la actividad nitrogenasa de las cepas endófitas se favorecen cuando estas se cultivan a pH entre ácido y neutro (pH = 5-7) [25]. La mayor actividad nitrogenasa de estos organismos está asociada con el suelo rizosférico o con el interior de la raíz, presentando una variación estacional que en algunos casos coinciden con la etapa reproductiva de la planta [26]. Estos microorganismos son capaces de solubilizar más de 450 mg.ml^-1 de fósforo en suelos con altas concentraciones de metales pesados y con condiciones de alta humedad y temperatura [24]. Inclusive, algunos biofertilizantes tienen la capacidad de solubilizar fosfato en suelos con altas concentraciones de agroquímicos. El contenido total de fósforo en los suelos es de 0.05%, y únicamente el 0.1% del total de fósforo está en forma disponible para las plantas, ya que la mayor parte está en forma insoluble como parte de fosfatos de calcio y hierro [27].

En cuanto a los porcentajes de N y P en el tejido foliar de plantas de maíz estos fueron mayores en las plantas inoculadas con los biofertilizantes con respecto a los controles (químico con N y P) y absoluto (sin inoculación). Estos resultados sugieren que las plantas inoculadas con algún microorganismo estimulan su crecimiento y desarrollo al presentar una mayor capacidad para absorber más eficientemente el agua y los nutrientes del suelo a través del estímulo provocado en el sistema radical, que se evidencia en el estado nutricional de las plantas [28].

Estudios similares sobre la evaluación del efecto de inoculación de Azospirillum sp. en el cultivo de maíz, muestran que las plantas presentaron un porcentaje de absorción de nitrógeno en el tejido foliar del 2.92% [29], mientras que la inoculación de A. brasilense y P. fluorescens incrementaron el contenido de fósforo total en 1698 kg. ha^-1 sobre el testigo con 187 Kg. ha^-1 [30].

Los resultados obtenidos en el presente estudio podrían atribuirse a que ambos géneros bacterianos tienen la capacidad de fijar nitrógeno y producir compuestos promotores del crecimiento vegetal (PGPR) [31]. Estos géneros bacterianos producen una generación y expansión del sistema foliar e incremento en la expansión radicular, permitiendo a las plantas promover su capacidad competitiva y de absorción de nutrientes del suelo el cual se ve reflejado en el contenido de nitrógeno absorbido por la planta de maíz variedad [32]. La absorción de fósforo y nitrógeno tiene una relación directa con la morfología de la planta es decir, que cuanto más fósforo y nitrógeno foliar fue tomado por las raíces de la planta, mejor es el desarrollo de su sistema foliar y radical [3]. En conclusión, la biofertilización a base de cepas Azospirillum sp y Pseudomonas fluorescens, solos o en combinación promovieron una mayor asimilación de contenidos de N y P en el tejido vegetal. Razón por la cual el uso de estos biofertilizantes puede ser una estrategia sostenible para complementar o reducir el uso de fertilizantes químicos e incrementar la productividad del maíz en la sierra del Ecuador.

Agradecimientos

Al Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias INIAP- Programa de Maíz, (Estación Experimental Santa Catalina) por su valiosa colaboración en el establecimiento y gestión del experimento.

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Información adicional

CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES: Carlos Sangoquiza concibió la investigación y trabajo en la toma de datos, labores de campo, laboratorio, análisis estadístico y redacción del manuscrito; Carlos Yánez, desarrolló la metodología de la investigación, validación y verificación de los resultados; Misterbino Borges, participó como tutor en la investigación así como en la revisión crítica del contenido intelectual del manuscrito.