La Nanotecnología está rápidamente cambiando el paradigma de los sistemas de fabricación de una estrategia “top - down” a una estrategia “bottom-up” [1]. Estos procesos que siguen la estrategia “bottom-up” explotan el “autoensamblaje” del material involucrado. Uno de tales materiales con la habilidad de auto ensamblar- se es el ADN [2, 3]. La creación de sistemas moleculares/nanosistemas capaces de realizar funciones complejas integrando múltiples componentes como es en el caso de toda nuestra tecnología basada en la estrategia tradicional top-down es aún un desafío tecnológico muy importante [1, 4]. Las principales limitaciones son la capacidad de diseñar sistemas que sin una inversión importante de energía o de manipulación excesiva puedan ensamblarse por sí mismos en un sistema capaz de realizar una función compleja. Por el momento aún estamos principalmente en la etapa de encontrar materiales que se auto ensamblan en estructuras dentro de la escala nanométrica que por sí mismos posean ya una aplica- ción tecnológica directa. Aquí presentamos un sistema multicomponente del mismo material (ADN) en lo que podría constituir los bloques de construcción de sistemas nanoscópicos funcionales basados en ADN en la frontera entre un sistema molecular y un nanosistema multi componente. Nuestro bloque de construcción básico consiste en ADN con un elemento de cadena doble con un segmento interno de varias guaninas contiguas en ambas cadenas y un segundo elemento constituido por extremos de cadena simple. Estos nucleótidos (en doble cadena) fueron incubados en solución amortiguadora con potasio y el biomaterial formó especies de alto peso molecular (nanofibras) que contienen segmentos de ADN G-cuádruple sin necesidad de ninguna otra manipulación adicional al control de la temperatura del medio usando un termociclador básico.

Tabla 1 Tabla 1 Lista de Amortiguadores 13

El ADN G-cuádruple es una molécula de ADN donde participan guaninas (G), que pueden estar en la misma cadena o en distintas cadenas, para formar una estructura estabilizada por enlaces de hidrógeno con cuatro Gs en un mismo plano, una tétrada (Ver Figura 1) [5]. Una molécula de ADN G-cuádruple tiene al menos dos de estos planos o tétradas apilados consecutivamente uno sobre el otro. La estructura además de ser estabiliza- da por los puentes de hidrógeno es estabilizada por cationes como sodio, o potasio que se encuentran alinea- dos con el espacio en el centro de las cuatro guaninas (una especie de canal rodeado de cuatro átomos de oxígeno, uno por cada guanina) y aproximadamente centra- do con respecto al eje longitudinal de la molécula entre dos tétradas consecutivas de ADN G-cuádruple [6]. En la literatura se ha reportado la fabricación de varias nanoestructuras basadas en ADN G-cuádruple [7, 8]. Uno de los posibles mecanismos de construcción es el auto apilamiento de unidades de G-cuádruple para formar estructuras aproximadamente cilíndricas y helicoidales. Se ha observado que oligonucléotidos (especialmente a altas concentraciones) con varias guaninas consecutivas en su secuencia forman superestructuras donde múltiples bloques de G-cuádruple se auto apilan, ya sea de forma que un bloque se apila sobre el otro, o donde una de las cadenas del G-cuádruple se desalinea o desplaza un “peldaño” dejando una o más guaninas expuestas, permitiéndole ahora a esta subunidad interactuar con la subsiguiente unidad de G-cuádruple [9 – 11]. Reciente- mente, también se han caracterizados sistemas sencillos en los que se observa una región G-quadruplex y una región de ADN de doble cadena [12]. Sin embargo en todos estos sistemas el tipo de secuencias de ADN involucradas en el ensamblaje es limitado (en cuanto a posibilidad de combinación y uso de múltiples secuencias y complejidad de las secuencias). En el sistema propuesto en este artículo demostramos una metodología que no se restringe a una única secuencia de ADN pero que puede utilizar cualquier secuencia de ADN en tanto contenga una pequeña sección de bases guaninas consecutivas no apareadas en alguna región interna de la molécula. La exploración de sistemas cuyo ensamblaje se pueda guiar por un delicado control de la temperatura permitirá generalizar y ampliar el uso del ADN como material base para nanoestructuras parte de biosensores, nano máquinas y otras aplicaciones [2, 6].

Figura 1 Figura 1 ADN Gcuádruple Está formado por cuatro Guaninas en el mismo plano La línea entrecortada azul muestra los puentes de hidrógeno tipo Hoogsteen total ocho por plano El ión central no se muestra Se utilizó el programa VMD para preparar el gráfico

Tabla 2 Tabla 2 Lista de secuencias utilizadas 6

Nombre	Largo	Secuencia 5’ a 3’
C1A	39	ACAGTAGAGATGCTGCTGATTCGTTCATGTGCTTCAAGC
C1B		TGTCATCTCTACGACGACTAAGCAAGTACACGAAGTTCG
SQ1A	39	CAGTAGAGATGCTGCTGAGGGGGGGGTGTGCTTCAAGCG
SQ1B		CTCTACGACGACTGGGGGGGGACACGAAGTTCGCTACTG
C2	29	TCTACGACGACTGGGGGGGGACACGAAGT

Figura 2 Figura 2 Visualización en New Cartoon y QuickSurf en VMD de un posible modelo tridimensional para el duplex formado por las secuen- cias SQ1A/SQ1B. Esferas amarillas corresponden a iones monovalentes en la región correspondiente a la región rica en Guaninas.

Todos los oligonucleótidos de ADN se adquirieron de Midlan Oligos (Midland, TX, USA) y fueron re suspendidos en agua purificada con un contenido de orgánicos totales menor a 34 .g/L y resistividad de 18.2 MΩ·cm. Se utilizó cloruro de tetrametil amonio (ClTMA), per- sulfato de amonio, mercaptoetanol, MgCl., KCl, tris (hi- drometil) aminometano (TRIS), ácido bórico de grado bioquímico o equivalente. Los experimentos de gel electroforesis y microscopía de fuerza atómica se realizaron como fue previamente reportado por nosotros [13]. Las soluciones amortiguadoras que se utilizaron se reportan en la Tabla 1.

En resumen, se logró ensamblar nanofibras de ADN a partir de elementos de ADN que consistian de una hebra de doble cadena, con una sección desapareada rica en Guaninas en el centro de la estructura y dos terminales de cadena simple a cada lado de la estructura. Las distintas pruebas sugieren que el mecanismo de ensamblaje incluye intermediarios de estructura G.cuádruple. Para llegar a estas nanofibras, se siguió una secuencia cuidadosa de caracterización de cada elemento. Como primer control para explorar la formación de especies G-cuádruple se utilizó la secuencia C2 (ver Tabla 2) que se diseñó para ser complementaria a nuestra secuencia de prueba SQ1A (una de las dos secuencias que constituirá al final las nanofibras). C2 es un olignucleotido que tiene 10 bases menos que la secuencia de prueba SQ1A. Por tanto, la formación de especies G-cuádruple a partir de solo secuencias C2 y solo secuencias SQ1A se podrán fácilmente distinguir entre sí y de las formadas a partir de un intermediario de doble cadena SQ1A con C2. Por ejemplo, la secuencia (C2). tendrá una movilidad en el gel distinta que la especie (C2).SQ1A. Esto nos permitió distinguir si las especies obtenidas se forman a través de lo que denominaremos la vía del ADN- sinapsable como intermediario versus la vía en la que simplemente las cadenas se juntan al azar en la solución. La vía a través del ADN sinapsable es la ruta en que primero se forma un DNA de doble cadena entre dos cadenas complementarias (Ej SQ1A con SQ1B) y a continuación dos moléculas de ADN de doble cadena interactúan entre sí para formar una nueva especie tetramolecular. El nombre “DNA-sinapsable” se originó debido a que esta vía nos recuerda el proceso en biología denominado sinápsis durante la primera fase de la meiosis donde tenemos cuatro hebras de ADN interactuando [14, 15]. Si este proceso de formación vía intermediario de “ADN sinapsable” es el que se siguió durante la formación de nuestras nanofibras, no se pueden formar las especies tipo (C2).SQ1A como intermediarios pues esta combinación indicaría una unión al azar de las cadenas de ADN en la solución. Como se puede ver en la Figura 3 efectivamente no se observan bandas con movilidades que correspondan a especies tipo (C2).SQ1A. En la línea 2 se observan claramente dos bandas de mayor movilidad, la más rápida corresponde- ría a la cadena simple y la siguiente muy posiblemente a una especie G-cuádruple del tipo (SQ1B).. Esta línea 2 nos puede servir de guía para interpretar las otras ban- das. Adicionalmente vale señalar la presencia de bandas de movilidad menor en varias de las líneas del gel e incluso un poco de retención de ADN en los posillos lo que debería corresponder a las nanofibras o sus precursores oligoméricos de mayor tamaño/peso molecular que las cadenas simples de ADN o los correspondientes G-cuádruples. Finalmente es necesario señalar que las secciones de cadena simple en los extremos de los ADN precursores de doble cadena no son complementarios con ninguna secuencia de cadena simple libre en el ADN precursor. Sin embargo, se diseñó la secuencia de esta forma con la finalidad de en un futuro utilizar estos segmentos como puntos de anclaje o de unión a otros tipos de nanoestructuras en base a ADN.

El ADN fue teñido utilizando SByr Green I. Las mues- tras en el gel (Figura 3) en orden de izquierda a derecha incluyen línea 1. 2.0 .M C2, línea 2. 2.0 .M SQ1B, lí-

nea 3. 1.0 .M duplex C2 + SQ1A, línea 4. 1.0 .M de ADN de doble cadena SQ1, línea 5. 1.0 .M C2 + SQ1A y 1.0 .M SQ1, línea 6. 2.0 .M C1 A. línea 7. 2.40 .M C2 + SQ1A a y 2.4 .M SQ1. Línea 8. 100 bp DNA

ladder. El gel se corrió en 0.10 KMgTb, pH 7.8.

Una vez que se caracterizó los precursores de las nanofibras y dada la presencia de especies de alto peso molecular, posiblemente fibras o sus precursores, se procedió a adquirir imágenes de AFM para identificar la presencia de estas nanoestructuras, así como caracterizar su morfología. Como se observa en la Figura 4, una muestra en base a SQ1A y SQ1B a una concentración de 0.0067 .M por cuádruple cadena, calentada a 90 ◦C por 5 minutos y mantenida a 50 ◦C por 72 h muestra la presencia de especies fibrilares. Bajo otras condiciones también hemos observado la formación de nanofibras [13]. Considerando que las unidades fundamentales solo tienen 39 nucleótidos, el tamaño de estas fibras indica el ensamble de varias decenas de unidades como constituyentes de estas nanofibras. No se escapa a nuestro diseño del esquema original que este material deja puertas abiertas y accesos para combinar las nanofibras con otros segmentos nanométricos en base a ADN u otros materiales como nanopartículas metálicas.

Figura 4 Figura 4 Imagen de microscopia de fuerza atómica en modo tapping a Sección de la variación en altitud en la imagen a lo largo de la línea blanca b La muestra consiste en fibras basadas en Gcuádruple y dúplex muestras incubadas por 72 h a 50 ◦C La barra de escala corresponde a una distancia de 250 nm

A futuro, se puede conseguir un control de la morfología final de las fibras a través de un control de la temperatura, identidad y concentración de iones en las soluciones amortiguadoras a usar potencialmente pueden controlar la longitud y número de fibras a formarse. Comparando los resultados que hemos reportado previamente [13], y las condiciones aquí descritas observamos que efectiva- mente un cambio en condiciones experimentales afecta profundamente la morfología (tamaño, distribución, longitud) de las nanofibras. Finalmente, considerando la potencial importancia de estructuras de autoensamblaje de ADN en nanotecnología [2, 18], los resultados reportados en el presente trabajo muestran una vía sencilla para combinar dos tipos muy distintos de estructuras en base a ADN (con sus propias características y propiedades como biomateriales) en una misma nanoestructura. El método tiene potencial impacto para la nano fabricación de andamiaje para la creación de nanoestructuras funcionales más complejas.