INTRODUCCIÓN
En la actualidad muchos microorganismos son cultivados a escala industrial debido a su
versatilidad y variedad de aplicaciones. Por ejemplo, los microorganismos están siendo
utilizados para producir moléculas bioactivas y biomateriales, los microorganismos
también están siendo modificados genéticamente y se los cultiva para estandarizar cepas,
o por sus aplicaciones en procesos de biorremediación y de biología sintética [1]. Además,
con frecuencia es necesario cultivar microorganismos para enumerar la cantidad de
microorganismos viables y establecer tasas de crecimiento y muerte celular [2-3].
Debido al inmenso número de especies microbianas existentes, de las cuales sólo una
pequeña fracción es cultivable bajo condiciones de laboratorio; se han desarrollado
modernas técnicas moleculares tales como los análisis metagenómicos combinados
con secuenciación masiva, para el estudio de las comunidades microbianas ambientales
o patógenas, y para entender su diversidad, filogenia y ecología [2, 4-5]. Aun así, el cultivo
de microorganismos continúa siendo fundamental para la identificación, aislamiento
y recuento de células viables o para establecer su uso potencial en aplicaciones
biotecnológicas subsecuentes [1-2, 4]. Por tal motivo, es un desafío desarrollar y
optimizar técnicas convencionales de cultivo, sobre todo en la bioprospección de
microorganismos presentes en muestras ambientales de matrices complejas [2, 3, 6-7].
Entre los microorganismos de interés, las bacterias sulfato reductoras (BSRs)
conforman un grupo diverso y ubicuo de procariotas anaeróbicos estrictos, que son parte fundamental de los ciclos globales del azufre y del carbono [8-10]. Las BSRs se
caracterizan por ser las responsables de reducir sulfato a sulfuro como parte de su
metabolismo y el sulfuro biogénico cataliza la bioprecipitación de metales durante la
biorremediación de efluentes de la industria minera [11-12]. Las BSRs están presentes en
variedad de hábitats anaeróbicos: sedimentos marinos, pantanos, microbiota intestinal,
sistemas de tratamiento de aguas residuales industriales o instalaciones de extracción
de gas y petróleo [9-10]. Microscópicamente, las BSRs son de color negro o pardo y
tienen diversas formas como cilindros, derechos o curvos, ovoides, cocos, entre otros [6].
El cultivo de microorganismos incluye la recolección de muestras, la preparación de
diluciones, la siembra en medios selectivos de cultivo, y la incubación bajo condiciones
controladas y reproducibles [2]. En medios sólidos de cultivo, el crecimiento microbiano
se evidencia en el desarrollo de agrupaciones de muchas bacterias, formadas a partir
de una o varias células viables (unidades formadoras de colonias, UFC), denominadas
colonias [13-17]. Al tratarse de microorganismos anaeróbicos, las BSRs tienen períodos
de incubación de hasta 30 días, dependiendo de la tasa de crecimiento de cada cepa
[13]. Las condiciones adecuadas de incubación para el cultivo de BSRs se dan en una
atmósfera inerte, con una proporción variable de dióxido de carbono para el crecimiento
de ciertas especies y como máximo 0.1% de oxígeno; esto, en un rango óptimo de
temperatura entre 25 y 40oC, aunque algunas termófilas pueden desarrollarse por
sobre los 70oC [6-7]. Adicionalmente, los medios de cultivo selectivos para las BSRs son
aquellos cuya relación de fuente de carbono expresada como demanda química de
oxígeno (DQO), respecto a la concentración sulfato está en el rango de 0,8 a 1,7 [15].
Debido a que el oxígeno tiene efecto bactericida y/o bacteriostático sobre los
microorganismos anaeróbicos estrictos, debe obtenerse una atmósfera libre de
este gas para alcanzar el óptimo crecimiento celular; igualmente son importantes la
temperatura de crecimiento y la composición adecuada del medio de cultivo [18-19].
Los sistemas anaeróbicos para siembra y/o cultivo incluyen botellas para bioensayos en
matriz líquida, requieren jarras de incubación tipo GasPak y cámaras flexibles o rígidas
provistas de guantes aislantes. Las cámaras rígidas con guantes son las más apropiadas
y versátiles; aunque su costo inicial es alto y, en ocasiones, la imposibilidad de establecer
condiciones de cultivo para microorganismos específicos suela ser una desventaja [19].
En este contexto, el objetivo del presente estudio fue construir una cámara anaeróbica
rígida del tipo caja con guantes de bajo costo; y, probar su funcionamiento en la
siembra, cultivo y recuento de las BSRs por la técnica de vertido en placa. Las muestras
ambientales analizadas corresponden a lodos de sedimentos de una laguna artificial,
lodos anaeróbicos enriquecidos, lodos provenientes de un biorreactor sulfato reductor
y una suspensión bacteriana. Las condiciones de anaerobiosis fueron monitoreadas al
interior de la cámara, siendo medidas la temperatura y la concentración de oxígeno
durante la operación del sistema. La viabilidad cualitativa de los microorganismos
anaeróbicos fue evaluada a través de la observación microscópica de las células y las
colonias. Además, los resultados obtenidos por recuento en placa fueron comparados
con los de conteo celular directo mediante cámara de Neubauer.
El presente trabajo es innovador por la potencial aplicación de esta cámara en un amplio
rango de experimentos microbiológicos en que se requieran condiciones anaeróbicas
de siembra y cultivo [19].
MATERIALES Y MÉTODOS
Requerimientos estructurales
Un sistema de ambiente anaeróbico debe ser eficiente y capaz de alcanzar
productividad óptima en un espacio compacto. Por tal motivo, el volumen interno de
la cámara anaeróbica es idealmente de entre 0,1 y 0,3 m3, con capacidad de hasta 200
placas por lote de incubación y que permita el trabajo y movilidad, controlando todos
los procedimientos de siembra [19-20]. Los materiales de construcción de la cámara
deben ser resistentes y facilitar la limpieza adecuada del ambiente de trabajo [21].
Los costos del proceso de construcción y puesta en marcha fueron registrados en el
periodo comprendido desde octubre de 2016 hasta enero de 2017, y el costo total fue
actualizado a valor presente (año 2018).
Requerimientos operativos
Las condiciones operativas óptimas para el crecimiento de las BSRs mesófilas son
rangos de temperatura de 28-32°C y atmósfera anaeróbica a presión normal de 1 atm,
constituida por una mezcla gaseosa formada mayormente (80%) por un gas inerte
como el nitrógeno (N2) y, 20% de dióxido de carbono (CO2) ya que es requerido para
el adecuado metabolismo de algunas especies [9]. Para monitorear las condiciones de
anaerobiosis, la concentración de oxígeno (O2) fue medida en el tiempo, utilizando un
medidor OPTIMA 7 BIOGAS (Humble, TX, USA) del proyecto IDEMA del Departamento
de Ingeniería Química de la USFQ. Y, la temperatura fue monitoreada utilizando un
termómetro digital 4126 Control Company (Webster, TX, USA) del Laboratorio de
Ingeniería Ambiental de la USFQ (LIA-USFQ). Las medidas ergonómicas de trabajo
fueron consideradas de tal manera que prevengan desórdenes músculo-esqueléticos
de los operadores [22].
Medio de cultivo
El medio basal mineral (MBM) estuvo compuesto por: 280 mg L-1 NH4Cl; 195 mg L-1 KH2PO4 ; 49 mg L-1 MgSO4 ; 10 mg L-1 CaCl2 ; 3.000 mg L-1 NaHCO3 ; 10 mg L-1 extracto de levadura; 2.900 mg L-1, Na2SO4 ; 5.300 mg L-1 CH3 COONa y 1 mL L-1 de una solución de elementos traza. La solución de elementos traza estuvo constituida por: 50 mg L-1 H3BO3 ; 2.000 mg L-1 FeCl2 ∙4H2O; 50 mg L-1 ZnCl2 ; 32 mg L-1 MnCl2; 50 mg L-1 (NH4)6 Mo7O24 ∙4H2O; 50 mg L-1 AlCl3 ; 2.000 mg L-1 CoCl2∙6H2O; 50 mg L-1 NiCl2∙6H2O; 44 mg L-1 CuSO4. 5H2O; 100 mg L-1 NaSeO3∙5H2O; 1.000 mg L-1 EDTA; 200 mg L-1 resarzurina y 1 mL L-1 de ácido
32
clorhídrico al 36% [23]. La resarzurina contenida en la solución de elementos traza
funciona como indicador para observar la posible pérdida de anaerobiosis [19].
El medio de cultivo fue preparado con MBM suplementado con acetato de sodio (JT
Baker Chemical Company. Phillipsburg, NJ, USA) como fuente de carbono, en una
concentración equivalente a 2,5 g DQO L−1 y 2,0 g SO4
2− L−1 a partir de sulfato de sodio
4
(JT Baker Chemical Company. Phillipsburg, NJ, USA), en una proporción acetato/sulfato
de 1,25:1. El pH del medio de cultivo fue ajustado con ácido clorhídrico o hidróxido de
sodio, según fuera el caso, hasta alcanzar valores de entre 7,8 y 8,2 [6-7].
Obtención y preparación de las muestras
Lodos de una laguna artificial: Una muestra de lodos anaeróbicos fue recolectada de los
sedimentos tomados a una profundidad aproximada de 1,2 m, en una laguna artificial en
el campus Cumbayá de la Universidad San Francisco de Quito (USFQ), Ecuador. Los lodos
fueron almacenados a 4oC hasta su uso. El contenido de los sólidos suspendidos totales (SST )
y de los sólidos suspendidos volátiles (SSV) en el lodo fueron 51,7 y 5,9%, respectivamente. La
actividad sulfidogénica máxima específica fue 4.337 mg S2- kg-1 SSV d-1.
Lodos anaeróbicos enriquecidos: Esta muestra fue obtenida a partir de lodos anaeróbicos,
los mismos descritos en la sección previa que fueron enriquecidos en medio de cultivo
líquido. El enriquecimiento fue llevado a cabo bajo condiciones anaeróbicas y por triplicado,
utilizando medio líquido de cultivo estéril y añadiendo 10% p/v de lodo anaeróbico. El
medio de cultivo no fue reemplazado durante todo el tiempo de incubación. Utilizamos
botellas de vidrio estériles de 160-mL de capacidad, que fueron herméticamente selladas
con tapas de caucho y aluminio. El aire contenido en el espacio de cabeza o headspace
fue desplazado con N2 y las botellas fueron incubadas durante 45 días bajo oscuridad en
una incubadora a 30±2°C. Una vez concluido el periodo de incubación, la muestra fue
analizada por los dos métodos de enumeración propuestos.
Lodos de un biorreactor sulfato reductor: Una muestra de lodo fue obtenida de un
biorreactor sulfato reductor a escala laboratorio, provisto de una pre-columna de piedra
caliza, durante la remoción de cobre (II); en dicho reactor había sido monitoreada su
actividad sulfato reductora durante dos años [24]. La muestra fue colectada en un
recipiente estéril de plástico y almacenada a 4oC hasta su enumeración.
Suspensión bacteriana: Diluciones de lodo sulfato redactor enriquecido fueron
sembradas en un medio de cultivo sólido, al que se le añadió 1,5% p/p de agar (BactoTM
Agar, Difco Laboratories, Bordeaux, France). Después de un período de incubación de
entre 28 y 30 días a 30oC bajo condiciones anaeróbicas [14], las colonias aisladas fueron
re-suspendidas en botellas estériles conteniendo medio líquido de cultivo. Después de
someter el cultivo a las mismas condiciones de incubación que las de las muestras de
lodo enriquecido, la suspensión bacteriana fue inmediatamente sometida a conteo en
cámara de Neubauer y recuento en placa.
Microscopía
Las células bacterianas de colonias y en las suspensiones fueron observadas por microscopía
de luz (microscopio Leica AME. Werzlar, Germany). No se utilizó ninguna coloración. Para el
objetivo 100 X se usó aceite de inmersión y no se utilizó ninguna coloración.
Enumeración celular mediante cámara de Neubauer
Al mismo tiempo de la siembra en placa, el número total de BSRs presentes en las
muestras fue analizado mediante una cámara de Neubauer 0,1 mm depth (BOECO,
Hamburg, Germany); y, durante la etapa exponencial de crecimiento [25-26]. En cada
caso, la muestra fue diluida en solución salina estéril (0,9% NaCl, p/v). Debido al color
negro característico de las BSRs, no se requirió tinción alguna [27]. El número total de BSRs por mL fue calculado siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
El recuento total de BSRs incluye tanto las células viables como las no viables. Todas las
muestras fueron analizadas por triplicado.
Recuento bacteriano en placa
Para cuantificar las BSRs viables, una alícuota de 1 mL de cada muestra fue serialmente
diluida en 9 mL de medio de cultivo líquido estéril. Dentro de la cámara anaeróbica, una
alícuota de 100 μL de muestra no diluida (100) y de cada dilución (10-1 to 10-9) fueron
sembradas por triplicado por vertido en placa [14]. El medio de cultivo suplementado
con 1,5% agar fue previamente esterilizado y enfriado a 45oC, para luego dispensar un
volumen de entre 20 y 25 mL por placa o caja Petri. Se incluyeron controles negativos
que consistieron en medio de cultivo sin muestra. A continuación, también al interior de
la cámara anaeróbica, las placas de agar fueron incubadas en una atmósfera N2/CO2 (N2
AP grado 4,8 y CO2 AP grado 2,8. Linde, Quito, Ecuador), en proporción 80:20, a 30±0.5°C
durante 28-30 días. Finalmente, las colonias fueron contadas. El número de BSRs
viables, expresado como unidades formadoras de colonias (UFC) por mL, fue calculado
dividiendo el número de colonias para el volumen de muestra y multiplicando ese valor
por el factor de dilución. Cada muestra fue analizada por triplicado.
Análisis estadístico
Los resultados fueron comparados mediante análisis de varianza (ANOVA), con 95% de
intervalo de confianza, utilizando el software SPSS Statistics (IBM Corp., Nueva York, USA).
RESULTADOS
Descripción de la cámara anaeróbica
Las especificaciones y ficha técnica de la cámara anaeróbica construida constan en la
Fig. 1. El equipo tiene un solo compartimento hermético cuyas dimensiones son 100
cm de largo, 50 cm de ancho y 60 cm de altura; con un volumen útil de trabajo de 0,2 m3.
La cámara fue construida en acero al carbono ASTM 380, luego se le imprimó una capa
de antioxidante para dar la terminación superficial con una pintura termoconvertible de
base epóxica. Tiene una escotilla oblicua de apertura frontal y bisagras con mecanismo
de retardo, así como cerradura. Cuenta, además, con una ventana de vidrio templado
de 80 cm por 25 cm y 5 mm de espesor; y, un sello de caucho en todo el perímetro, que
garantiza la hermeticidad del sistema.
FIGURA 1
Cámara anaeróbica de siembra y cultivo USFQ. (1.a) Descripción del equipo. (1.b) Especificaciones
técnicas. (1.c) Diagrama del espacio de trabajo.
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Para procesar y sembrar las muestras, la cámara está equipada en su panel frontal con
mangas de guantes de látex de 60 cm de largo, resistentes al ataque químico, que
pueden ser regularmente reemplazados, y cuyo cuadro de paso es 39 cm. En la pared
posterior interna, cuatro resistencias simples del defrost de un refrigerador constituyen
el sistema calefactor que permite alcanzar en el interior de la cámara una temperatura
máxima de 50 ̊C, un rango adecuado para el cultivo de BSRs y otros microorganismos
anaeróbicos de interés.
El costo actual (2018) de construcción de la cámara, que incluye materiales, mano de
obra, instalación eléctrica, acoples, montaje, control automático y puesta en marcha, es
en total de 2.700 USD.
Operación de la cámara anaeróbica
La cámara anaeróbica opera con suministro eléctrico de 110 voltios y cuenta con un
interruptor en la parte externa superior izquierda que permite encender el equipo. La
cámara aneróbica posee un módulo que activa la iluminación al interior de la cámara;
mientras que dos puertos han quedado libres para controlar el generador de ozono y
la lámpara luz ultravioleta, que serán posteriormente instalados como mecanismos de
desinfección del área de trabajo.
La temperatura al interior de la cámara anaeróbica es manejada mediante un controlador
PID para temperatura, cuyos parámetros del controlador PID, proporcional “P”, integral
“I” y diferencial “D”, fueron obtenidos con el criterio de sintonía de Ziegler-Nichols [28].
Estas variables operativas de control de temperatura son ingresadas al controlador PID
mediante un teclado ubicado en la parte superior izquierda de la cámara anaeróbica,
que está provisto de una pantalla que también permite visualizar la temperatura interna
durante toda la operación.
Por otra parte, la atmósfera anaeróbica es conseguida por procedimiento manual,
mediante el desplazamiento del aire a través de una mezcla gaseosa de 80% de N2 y 20%
de CO2. Para ello, la cámara cuenta con dos válvulas y terminales de manguera, una en
la parte inferior derecha para el ingreso de la mezcla gaseosa y otra en la parte superior
izquierda para la salida. El tiempo de purga o flushing, abriendo ambas válvulas, al inicio de
la siembra y cultivo es de 15 minutos y cada 48 horas, durante el periodo de incubación,
se hace una purga preventiva o de mantenimiento de cinco minutos de duración,
equivalente a cinco veces el cambio del volumen interno de la cámara anaeróbica.
En la Fig. 2 se presenta la concentración de oxígeno y la temperatura al interior de la
cámara anaeróbica. En la Fig. 2.a se puede observar que se alcanzaron las condiciones
anaeróbicas ya que la concentración de oxígeno disminuyó de 21% a 0,1% durante
los 10 primeros minutos y se mantuvo en este rango [7]. Cabe indicar que, durante la
ejecución de los experimentos, las condiciones anaeróbicas se mantuvieron dentro
de la cámara ya que la concentración de oxígeno no superó el 0,1%; de igual manera,
la temperatura requerida fue estable y, por ende, el mecanismo de control instalado
funcionó eficientemente (Fig. 2.b). A partir de los 10 minutos, se obtienen condiciones
anóxicas y desde los 12 minutos, aproximadamente, se llega a la temperatura de control
establecida, correspondiente a 30oC.
Figura 2
Condiciones de concentración de oxígeno y temperatura al interior de la cámara. (2.a) Porcentaje de
oxígeno en la mezcla gaseosa. (2.b) Temperatura durante la operación. IN representa la condición estudiada al interior de la cámara y OUT, la condición ambiental, fuera de la cámara. CONTROL es el valor de control establecido.
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En la actualidad, la cámara se encuentra funcionando con normalidad en uno de los
laboratorios de Ingeniería Ambiental de la USFQ (LIA-USFQ).
Cultivo de BSRs
Figura 3
Microscopía de BSRs. (3.a.1) y (3.a.2) Colonias que se desarrollaron durante el cultivo. (3.b.1) Colonia
10X. (3.b.2) Colonia 40X. (3.b.3) Colonia 100X. (3.c.1) BSRs en suspensión antes de incubación en medio líquido.
(3.c.2) BSRs en suspensión luego de incubación en medio líquido.
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La Fig. 3 muestra las colonias de color negro-pardo y la recuperación cualitativa de estos
organismos sembrados, incubados e inspeccionados dentro de la cámara respecto a la
suspensión bacteriana (medio líquido). Tanto las colonias como las células observadas
son consistentes con la morfología esperada de las BSRs.
Enumeración de BSRs por recuento en placa en diferentes muestras
La concentración de BSRs fue determinada en cuatro muestras: una suspensión
bacteriana, lodos anaeróbicos enriquecidos, sedimentos de una laguna artificial, y
una muestra de lodos provenientes de un biorreactor sulfato reductor durante la
bioprecipitación de cobre (II); todas ellas fueron recolectadas o preparadas de forma
independiente.
Figura 4
Cuantificación de SRB por recuento de Neubauer (total) y cultivo de placa (viable) en cuatro
muestras: suspensión bacteriana, una muestra de lodo enriquecido, sedimentos de una laguna artificial y
lodos de un biorreactor sulfato reductor. Las barras representan el promedio de tres mediciones y las barras
de error representan la desviación estándar calculada. El asterisco (*) indica diferencias estadísticamente
significativas según la prueba ANOVA (p <5%).
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En la Fig. 4 se observa la concentración bacteriana determinada en cada muestra
mediante la cámara de Neubauer (recuento total) y por cultivo en placa (recuento
viable, UFC) empleando la cámara anaeróbica. La muestra de suspensión bacteriana
registra valores de 1,79 x 106 células viables por mL y 2,21 x 106 células totales por
mL por cultivo en placa y por conteo en cámara de Neubauer, respectivamente.
Los lodos anaeróbicos enriquecidos tienen concentraciones bacterianas de 8,70 x
105 células viables por mL por cultivo en placa y 7,63 x 106 células totales por mL
mediante conteo en cámara de Neubauer. En los sedimentos de la laguna artificial,
2,30 x 102 células viables por mL y 2,51 x 105 células totales por mL, por cultivo en placa
y por conteo en cámara de Neubauer, respectivamente. Mientras que en los lodos
provenientes de un biorreactor sulfato reductor durante la bioprecipitación de cobre
(II), los resultados indican 7,48 x 104 células viables por mL por recuento en placa y 5,91
x 107 células totales por mL mediante conteo en cámara de Neubauer. De acuerdo
a estos resultados, en la muestra de suspensión bacteriana los conteos de bacterias
fueron estadísticamente similares por los dos métodos de cuantificación empleados
(Fig. 4). Sin embargo, los recuentos bacterianos realizados en muestras de lodos,
sean éstas de una laguna artificial, enriquecidos o de un biorreactor sulfato reductor presentaron diferencias significativas entre los dos métodos de conteo en cuestión; es
decir, se produce una sobreestimación del recuento de bacterias utilizando el método
de la cámara de Neubauer cuando se analiza muestras de este tipo en comparación
con el conteo por cultivo en placa.
DISCUSIÓN
La cámara anaeróbica construida cumple con todos los requerimientos previamente
establecidos (Fig. 1). El costo de construcción de la cámara anaeróbica es
comparativamente menor (2.700 USD), si se considera que versiones comerciales, de
características similares, tienen precios FOB de entre 12.000 y 15.000 USD. Además,
esta cámara anaeróbica permite ejecutar las actividades de siembra y mantener las
condiciones ambientales anaeróbicas deseadas durante todo el proceso de cultivo.
Esto debido a que el espacio interior disponible es suficiente y a que las placas
sembradas pueden ser periódicamente inspeccionadas, sin necesidad de que se
comprometan las condiciones de cultivo, evitando así perturbar el lento crecimiento
celular de las BSRs [19].
Durante la operación de la cámara anaeróbica se mantuvieron las condiciones
óptimas de anaerobiosis y temperatura para el cultivo de las BSRs (Fig. 2); sin embargo,
el sistema puede ser mejorado implementando un módulo automático de cambio de
mezcla gaseosa al interior de la cámara anaeróbica, que será evaluado en el futuro.
Los resultados del presente estudio indican que microorganismos anaeróbicos
estrictos han sido exitosamente cultivados en la cámara anaeróbica y que es apreciable
su viabilidad (Fig. 3.), observándose colonias y células de bacterias capaces de crecer
en anaerobiosis y en un medio de cultivo selectivo para BSRs [27]. Se recomienda
realizar una identificación de especies mediante técnicas moleculares para confirmar
la presencia de BSRs [23, 26].
Los valores reportados (Fig. 4) por recuento en placa para muestras similares, son
similares a los reportados en la literatura utilizando la misma técnica analítica [14].
Cuando en la suspensión bacteriana se compara la concentración de BSRs obtenida
por cultivo en placa (viable, UFC) versus la concentración celular determinada por
la cámara de Neubauer, no hubo diferencia estadística significativa; mostrando
que la fracción viable y el recuento total de células fueron similares (Fig. 4). Estos
resultados sugieren que ambos métodos son válidos para la enumeración de BSRs
en suspensiones bacterianas en fase exponencial de crecimiento. Adicionalmente,
es razonable inferir que las condiciones ambientales al interior de la cámara fueron
apropiadas para el crecimiento de los microorganismos anaeróbicos estrictos [6-7, 15].
Al contrario, el recuento total de BSRs en la muestra de lodos enriquecidos fue
aproximadamente un orden de magnitud más alto que la concentración de colonias
determinada por siembra y cultivo en placa (Fig. 4), y que la concentración total de
BSRs fue significativamente mayor que la concentración de BSRs viables. Debido a que
los lodos enriquecidos pueden contener partículas minerales y que estarían presentes
otros microorganismos además de las BSRs, la determinación del número de células totales por el método de cámara de Neubauer es poco selectiva [29-30]. Otro factor a
considerar es que este conteo directo fue realizado con iluminación de luz visible y sin
colorantes de contraste que podrían haber permitido diferenciar los microorganismos
de interés [25, 30].
Según el análisis de varianzas, en las muestras de lodos de la laguna artificial y del
biorreactor sulfato reductor, los resultados de la enumeración por la cámara de
Neubauer (total) y de recuento en placa (viable) fueron estadísticamente diferentes,
lo que demuestra que también en estas dos matrices, la enumeración de BSRs por la
cámara de Neubauer reporta valores significativamente superiores a los reportados
por el método de siembra y recuento en placa (Fig. 4). Esto es atribuible a los motivos
antes enunciados y a que en la cámara de Neubauer se contabilizan células vivas y
muertas, o viables y no viables [30].
Finalmente, la construcción a bajo costo de una cámara anaeróbica de siembra
y cultivo fue culminada exitosamente. En esta investigación se ha demostrado su
operatividad de la cámara mediante el recuento en placa de BSRs, un grupo de
microorganismos anaeróbicos estrictos; con la limitación de no haber realizado
pruebas moleculares para su identificación. Los resultados experimentales obtenidos
validan la eficiencia de la cámara construida para su uso en la siembra y cultivo de
microorganismos anaeróbicos.